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脊髓橫斷模型(大鼠)——自由落體打擊法

時間:2025-02-05 11:19:15點擊次數:

一、實驗動物選擇

選用SD大鼠作為實驗對象,雌雄不限,周齡為6-8周。

二、造模具體操作步驟

1. 術前準備:造模手術前2小時,對大鼠腹腔注射青霉素鈉2×10?U,以此達到抗炎目的。

2. 麻醉、消毒與固定:完成相應準備工作。

3. 胸椎T10節段定位:用手觸摸大鼠背部,先找到胸椎最高點,從該點往上數3個棘突對應的椎體位置,即為胸椎T10節段。

4. 背部切口操作:在T9-T11節段對應的背部位置,做正中直切口。隨后使用止血鉗,以鈍性分離的方式,將開口處皮膚與肌肉層之間的黏膜分離開。

5. 暴露手術區域:借助輔助固定鉤將兩側皮膚拉開,使手術區肌肉視野充分展現。用眼科剪在中線(棘突邊緣)兩側的肌肉上做直切口。若出現少量出血情況,用棉簽清理手術區域。接著,用眼科剪剪掉T9-T11節段區域的棘突以及其他少量多余的肌肉組織,讓T9-T11節段的椎板完全暴露出來。

6. 脊髓背側暴露:去除兩側關節突,使脊髓背側呈現出直徑約0.5cm的圓形暴露區域。需要注意的是,暴露范圍必須大于選用的撞擊頭直徑,且不能有骨突殘留,避免重物自由下落時受到周圍組織的遮擋。

7. 打擊器位置與高度調整:把自由落體打擊器的位置調整到使撞擊頭移動至脊髓背側需要打擊的實驗位置,之后再對打擊器的垂直高度進行調整。調整至撞針球面剛好貼住脊髓骨膜,然后讓其自由抬高到合適位置(撞擊頭抬高2-3mm)。

8. 砝碼放置與定位:在撞擊針上方2.5cm高度處插入定位銷,挑選合適的砝碼(10g)放入金屬打擊管內。

9. 實施打擊:迅速拔出定位銷,讓砝碼以自由落體的方式撞擊撞擊針,從而產生25gcf的致傷能量。

10. 術后初步觀察:迅速移開自由落體打擊器后,仔細觀察大鼠的心跳和呼吸情況,確保無異常現象。

11. 縫合與抗感染處理:按照肌肉、筋膜、皮膚的順序依次進行縫合,縫合完成后用碘伏對切口及周圍進行消毒處理。在傷口周邊撒上青霉素粉劑,預防感染。

三、成模鑒定方法

1. 行為觀察:撞擊后若觀察到大鼠軀體出現顫抖,鼠尾呈現痙攣性擺動,雙下肢先迅速回縮撲動,隨后癱瘓,并且肉眼可見脊髓硬膜下有血腫形成,表明造模可能成功。假手術組大鼠僅進行棘突和椎板切除術,不開展SCI造模操作。

2. BBB運動功能評分法:觀察時長設定為4min,在125cm×125cm的空間范圍內進行評分。采用三人盲法,在評分前對評分人員進行培訓,使其深入掌握評分細則與標準。三位評分人員在同一時刻獨立觀察大鼠雙后肢的運動功能,并做好記錄與評分,最終選取三個評分中的最低值作為功能評分結果。BBB評分標準詳細說明如下:0-7分,重點關注關節是否活動以及活動關節的數量;8-14分,主要看腳掌能否接觸地面,著地后能否進行運動以及運動是否協調;15-18分,著重觀察腳尖能否抓地,腳尖方向與前進方向是否一致,前后肢運動是否協調;19-21分,主要判斷運動時軀干是否穩定,尾巴是否上翹。

BBB評分的定義:將動物放入以開口盆,輕敲盆壁,使其爬行,觀察動物的臀、膝、踝關節行走、軀干運動及其協調情況。BBB評分(Basso,Beattie&Bresnahanlocomotorratingscale,BBBscale)

(大鼠脊髓損傷)評分標準
0分無可見后肢運動
1分一或兩個關節輕微運動,通常為髖和/或膝關節
2分一個關節大幅活動或一個關節大幅活動且有另一關節輕微活動
3分兩個關節大幅活動
4分后肢全部三個關節可輕微活動
5分兩個關節輕微活動,第三個關節可大幅活動
6分兩個關節大幅活動,第三個關節可輕微活動
7分后肢全部三個關節可大幅活動
8分非承重情況下可以爪掌面著地
9分足底僅位于負重位,或偶爾/頻繁/持續以足背負重步行,無足底負重步行。負重:足底負重位時或僅在后軀干抬高時,HL伸肌收縮
10分偶見爪掌面承重移動;無前后肢協調動作
11分可較多的見到掌面承重移動,但無前后肢協調動作
12分可較多的見到掌面承重移動,偶見前后肢協調動作
13分常見掌面承重移動,可常見前后肢協調動作
14分有持續性掌面承重移動和前后肢協調動作;或出現常見的掌面移動,持續型前后肢協調動作,偶有爪背側移動
15分持續性掌面移動和持續性前后肢協調動作,前肢前進過程中無或偶有抓地;初接觸時主動爪位置與身體平行
16分步態中可見持續性掌面移動和持續性前后肢協調動作,前肢前進過程中常見爪抓地;初接觸時主動爪位置與身體平行,負重轉移后旋轉
17分步態中可見持續性掌面移動和持續性前后肢協調動作,前肢前進過程中常見爪抓地;初接觸時和負重轉移后主動爪位置均與身體平行
18分步態中可見持續性掌面移動和持續性前后肢協調動作,前肢前進過程中可持續性爪抓地:初接觸時主動爪位置均與身體平行,負重轉移后旋轉
19分步態中可見持續性掌面移動和持續性前后肢協調動作,前肢前進過程中可持續性爪抓地;初接觸時和負重轉移后主動爪位置均與身體平行。尾巴有時或總是下垂
20分持續性掌面移動,持續性協調步態,足趾持續抓地,初接觸時和負重轉移后主動爪位置均與身體平行,軀干不穩定,尾巴持續翹起
21分持續性掌面移動,持續性協調步態,足趾持續抓地,活動過程中主動爪位置始終與身體平行,軀干持續穩定,尾巴持續翹起
注:HL(hindlimb):后肢。輕度:小于等于百分之五十的關節活動范圍。大幅是指大于百分之五十的關節活動范圍。2個關節通常指髖關節和膝關節。第3個關節通常為踝關節

3. Rivlin斜板試驗:采用改良的Rivlin方法,使用一塊預先粘貼好3mm厚橡膠墊的長方形木板作為斜板,該斜板通過與底板連接的鉸鏈實現旋轉,以此調節斜板傾斜的角度。將大鼠放置在斜板上,使其頭部朝前,身體長軸線與斜板的縱軸垂直。檢測從水平位置(0°)起始,每次將斜板旋轉升高5°,逐步增大斜板與水平面之間的角度,記錄大鼠能夠停留5秒的最大角度,該角度即為其功能角度值。正常情況下,大鼠維持身體停留5秒時,斜板的傾斜角度約為73°。

4. HE染色:仔細且完整地取出傷段及頭尾段共1.0cm的脊髓組織,將其放入預先裝有4%多聚甲醛的離心管中,固定24小時后進行HE染色,隨后在光鏡下觀察脊髓損傷區及鄰近部位的病理變化情況。

四、造模周期

整個造模周期為3天。

五、后續檢測指標建議

仔細游離并完整取出傷段及頭尾段共1.0cm的脊髓組織,放入預盛有4%多聚甲醛的離心管中固定24小時,HE染色后光鏡觀察脊髓損傷區及鄰近部位的病理變化。

六、注意事項

1. 體溫維持:術后大鼠體溫通常較低,需將其放置在體溫維持儀上,保證體溫穩定。

2. 排尿護理:給大鼠進行排尿護理時,先用手指觸摸找到充盈的膀胱,接著按住膀胱底部,按照自上而下的方向輕輕擠壓,促使尿液排出。擠壓過程要保持耐心、動作輕柔,嚴禁粗暴用力。若尿液擠出困難,可用溫水適度刺激膀胱區及外生殖器。同時要避免對尿道區及外生殖器進行不當的機械刺激,防止出現尿道水腫及外生殖器水腫翻出的情況,并定期做好清潔工作。

3. BBB評分注意事項:進行BBB評分前,務必先將大鼠尿液排凈,防止影響實驗結果。評分時要認真、細致地觀察大鼠四肢的行走狀況,并做好記錄。

4. 術后全面護理:術后將動物分籠飼養,保證自然光照和通風良好。每天更換清潔、干燥的墊料,始終保持環境干燥。密切觀察動物的精神狀態、飲食情況、排尿排便狀況、有無肢體水腫和壓傷、有無泌尿系統血性分泌物等。每日進行3次人工排尿,腹腔注射青霉素,劑量為10萬U/次,每天2次。注意防止大鼠出現自殘行為以及腸梗阻現象。

5. 模型調整:模型嚴重程度可依據實驗具體要求,通過調整撞擊次數、撞擊高度來實現。建議在正式實驗前進行預實驗,以確定最合適的參數設置。



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